紫外交联仪在麦角硫因研究中的创新应用

01实验目的

　　麦角硫因(ergothioneine，EGT)作为一种天然手性氨基酸衍生物，存在硫醇和硫酮两种互变异构形式。研究表明EGT可抑制脂质过氧化损伤，清除羟自由基(·OH)、超氧化物和单线态氧(1O2)等多种活性氧(ROS)物质，是优异的皮肤光敏保护剂。通过紫外线照射光敏剂罗丹明B(RhB)溶液诱发包括1O2在内的自由基体系(简称UV-RhB体系)，模拟紫外线照射人体皮肤产生ROS的情况，研究EGT在此体系下的抗氧化性能及其稳定性，以期为EGT应用于抗衰护肤品的开发提供理论依据。

02实验方法

1. UV-RhB体系中EGT和VC抗氧化性能的测定

　　以pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS，取2.2 g Na2HPO4，0.3 g NaH2PO4和8.5 g NaCl，加水溶解至1000 ml)为溶剂，分别配制0.001 %罗丹明B溶液(RhB)、0~1.00 mg/ml的EGT溶液及维生素C(VC)溶液。按表1配制测定溶液体系I、II，置紫外光(波长254 nm，光强度5 mW/cm2)下照射。分别于0，1 h时，采用酶标仪，测定555 nm波长处吸收值(A0和A1)，每个样品平行3份，计算0 h和1 h吸光度变化量的平均值(ΔA)，以ΔA空白为基线，按下式计算体系中活性物质的抗氧化性能(F)。F(%)= (ΔA空白-ΔA样品)/ ΔA空白×100 ΔA空白式中，ΔA空白：空白对照溶液的吸收值的变化量(A0空白-A1空白);ΔA样品：样品溶液的吸收值的变化量(A0样品-A1样品)。

2.离子强度对EGT抗氧化性能的影响

　　按表1配制测定溶液体系III，EGT溶液浓度为0.25 mg/ml，以EGT浓度为0的体系作为空白对照，分别加入NaCl浓度分别为0 %，0.40 %，0.85 %，1.30 %，1.75 %的PBS。按2.1项下方法平行测定3份，取其平均值，计算不同离子强度体系的ΔA和F值。

3.pH值对EGT抗氧化性能的影响‍‍‍‍‍

　　按表1配制测定溶液体系IV，EGT溶液浓度为0.25 mg/ml，以EGT浓度为0的体系作为空白对照，用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分别调节PBS缓冲液pH值为3.0，5.0，7.2，9.0，11.0。按1项下方法平行测定3份，取其平均值，计算不同pH体系的ΔA和F值。

4.还原剂对EGT抗氧化性能的影响

　　按表1配制测定溶液体系V，EGT溶液浓度为0.25 mg/ml，并以EGT浓度为0的体系作为空白对照，Na2SO3溶液以PBS缓冲液为溶剂，浓度分别为0 %，0.02 %，0.05 %，0.10 %，0.25 %，0.50 %。按1项下方法平行测定3份，取其平均值，计算不同还原剂浓度体系的ΔA和F值。

5.金属离子对EGT抗氧化性能的影响

　　按表1配制测定溶液体系VI，其中溶剂为生理盐水，EGT溶液浓度为0.25 mg/ml，并以EGT浓度为0的体系作为空白对照。分别加入0.05 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+生理盐水溶液。按1项下方法平行测定3份，取其平均值，计算不同金属离子体系的ΔA和F值。

6.EDTA对EGT抗氧化性能的影响

　　按表1配制测定溶液体系VII，其中溶剂为生理盐水，EGT溶液浓度为0.25 mg/ml，并以EGT浓度为0的体系作为空白对照。分别加入0.10 mol/L的Fe3+溶液和0 %，0.02 %，0.04 %，0.10 %，0.20 %的EDTA溶液。按1项下方法平行测定3份，取其平均值，计算不同EDTA浓度体系的ΔA和F值。

03实验结果

1.EGT和VC的抗氧化量效关系

　　不同浓度EGT和VC的抗氧化性能见图1。由图1可见，0~1 mg/ml范围内，EGT和VC的F值随浓度的升高而增大，且相同浓度下EGT的F值一直高于VC，表明EGT和VC抗氧化作用具有较好的量效关系，同时在此体系下EGT的抗氧化性能优于VC。

2.离子强度对EGT抗氧化性能的影响

　　离子强度对EGT抗氧化性能的影响见图2。由图2可见，NaCl浓度在0 %~0.85 %范围内，EGT的F值较为稳定，当NaCl浓度高于0.85 %时，F值急剧下降，表明此时EGT抗氧化性能受到体系内高离子强度的抑制而显著降低。

3.pH值对EGT抗氧化性能的影响

　　pH值对EGT抗氧化性能的影响见图3。由图3可见，在pH 5~9范围内EGT的F值变化相对较小，表明EGT抗氧化活性在pH 5~9范围内较为稳定。

4.还原剂对EGT抗氧化性能的影响

　　还原剂亚硫酸钠对EGT抗氧化性能的影响见图4。由图4可见，随着亚硫酸钠浓度的增大，F值呈下降趋势，表明在此体系中加入亚硫酸钠可抑制EGT的抗氧化活性。亚硫酸钠浓度大于0.1 %时，F值趋于稳定，表明其抑制作用趋于平缓。

5.金属离子对EGT抗氧化性能的影响

　　不同金属离子对UV-RhB体系的影响见图5A。结果显示，与Na+体系相比，K+、Mg2+、Zn2+体系中ΔA空白变化较小，表明加入这3种离子对体系内RhB的降解速率影响较小;Cu2+对RhB的降解速率有较明显的抑制，而加入Fe3+后，体系中RhB降解速率显著提高，分析原因为Fe3+在水中形成Fe(OH)2+，经光照射生成Fe2+和羟自由基，增大了体系内自由基的浓度，进一步加剧了RhB的降解。

　　不同金属离子对EGT抗氧化性能的影响见图5B。结果显示，与Na+体系相比，Zn2+对EGT抗氧化性能没有明显影响，K+、Mg2+对EGT的抗氧化作用有一定程度的抑制，Cu2+在抑制RhB降解的同时对EGT的抗氧化性能也有较为明显的抑制作用。而在体系中加入Fe3+，RhB降解速率提高的同时，EGT的抗氧化性能也得到了明显的提升，这也表明EGT可有效抑制Fe3+诱发的氧化应激反应。

6.EDTA对EGT抗氧化性能的影响

　　EDTA对EGT抗氧化性能的影响见图6。由图6可见，在添加Fe3+的体系中，EGT抗氧化性能随EDTA的浓度增加而减小，分析原因为EDTA与Fe3+形成金属络合物后降低了体系内Fe3+的浓度，削弱了Fe3+对UV-RhB体系和EGT抗氧化性能的影响。

04实验结论

　　本文通过建立紫外辐射光敏剂诱发自由基体系，测定抗氧化活性物质的抗氧化性能。在此体系下EGT表现出优异的抗氧化性能，且在低离子强度和pH 5~9范围内具有良好的稳定性。