RT-PCR虚拟实验-2

  【左侧】：电动匀浆机^*、台式离心机、盛有冰的容器（不带盖）、玻璃平皿^**、微量取液器、盛有消毒枪头的塑料盒、EP管、1ml匀浆瓶、无菌手术刀^*、无菌手术镊^*、计时器

           （^*鼠标箭头放上：说明框显示：“DEPC水处理过”，3秒钟后消失；

^**鼠标箭头放上：说明框显示：“所有玻璃器皿先用酸处理，冲洗干净，高压消毒”，3秒钟后消失）

   【右侧】：待提取组织（肝脏）、DEPC水^*、异丙醇、氯仿、75%冰乙醇

            (^*鼠标箭头放上：一秒钟后“实验注意”显示：1%焦碳酸二乙酯：去除外源性RNA酶)

   【画面中央】：工作台：一块象征性的平台，有“工作台”字样

            （鼠标箭头放上：一秒钟后“实验注意”显示：DEPC水处理过）

   【画面右下角】：垃圾桶（有骷髅头图形标记）

   【界面按钮设计】：实验注意：有内容时自动显示

                    实验提示：步箭头放上自动显示，以后每一步均自动显示

                     重新操作：返回到上一步结束

退出实验：回到本步骤界面

退出运行：回到首页

关闭音乐：实验开始，背景音乐自动响起。按此键，即关闭音乐

1、工作台中央的盛冰的容器---容器中放有和容器口齐平的碎冰。

   实验提示：按顺序选择玻璃平皿、肝脏组织、手术刀，切碎标本。

 

2、切碎标本 ------ 选择玻璃平皿放置于盛冰容器中央，拖动肝脏组织放置于玻璃平皿中（鼠标箭头放置于肝脏上时，说明框显示：0.1g小鼠肝脏，3秒钟后隐去）。点击无菌手术刀，拖动手术刀至肝脏组织上（该动作完成后，自动出现说明框：切碎肝脏组织，同时手术刀上下做切碎动作，三秒钟后动作停止，手术刀回到原位）。

   实验提示：使用无菌镊子，将肝脏组织放入1ml匀浆瓶内。

 

3、移动1ml 匀浆瓶----点击匀浆瓶，并拖动至工作台中央的冰盒内；点击无菌镊子，鼠标变为镊子形状，将玻璃平皿上的切碎组织夹入匀浆瓶内（该动作完成后，玻璃平皿及无菌镊子回到工作台界面原位）

     实验提示：点击微量吸液器，点击装有枪头的塑料盒，盒打开。微量吸液器装上枪头，拖动微量吸液器至Trizol处，吸取Trizol，加入EP管。

 

4、加入Trizol---- 1 点击微量吸液器（说明框显示“吸取1ml液体”，3秒钟后隐去）；2 点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“1ml枪头”，3秒钟后隐去），加入到微量吸液器上（枪头为蓝色）；3点击微量吸液器，拖动至Trizol处，点击Trizol（枪头内显示吸取1ml红色液体）；4拖动微量吸液器至匀浆瓶处，点击微量吸液器（出现枪头内液体注入EP管内的画面），液体注入后，微量吸液器回到吸液架上。

    实验提示：选择匀浆机；拖动匀浆瓶至匀浆机；点击匀浆机，匀浆两次，至匀浆瓶内液体变为均一液体。

 

    5、匀浆----

①    动画显示逆时针拧松电机套下端连接螺纹（不用全部拧下），插入1ml匀浆杵子后顺时针拧紧（如插入较紧时可边插边用手往上拧）。文本框显示“拧松电机套下端连接螺纹（不用全部拧下），插入1ml匀浆杵子后拧紧（如插入较紧时可边插边用手往上拧）”

②    将1ml匀浆瓶夹在试管夹上，对好中心，握住手柄上下试动，至完全对直，再把瓶子夹紧（动画显示红色手柄下拉，匀浆杵子伸入匀浆瓶内，瓶子夹紧后自动恢复）

③    点击冰盒，拖动到匀浆瓶底部，打开冰盒盖，使匀浆瓶底部接触冰。（文本框显示“加冰浴防止温度升高使组织失活”） 冰盒 开盖后里面的冰

④    打开电源开关，把调速调至最小，右手把握控制手柄，

运动杵子至瓶口配合处，调节调速旋扭至所要的速度。即开始匀浆，控制手柄向下运动至瓶底部（不能太用力），再往上运动至与瓶配合处，往复运动至成红色均一液体。

       ⑤ 匀浆机回到原位置，匀浆瓶仍位于冰盒中，将匀浆瓶内液体倒入1.5ml离心管内，离心管置于冰盒内，匀浆瓶自动消失。

 

文本框显示：

“实验注意：1、电动玻璃匀浆机严禁在匀浆杵子未放入匀浆器内时悬转，及无放入组织、液体等空瓶研磨。

2、      如使用中由于负载过大（往往运动过快）发生卡住时，手柄应速向上运动但匀浆杵子不脱离液面。

3、      匀浆要彻底，如一次匀浆不彻底，需再进行一次”

 

          实验提示：点击EP管，拖出冰盒，点击计时器，室温下静置5分钟。

实验提示：静置使细胞充分裂解，核蛋白中核酸与蛋白解离。

 

     6、静置---- 1点击EP管，拖动EP管至冰盒外，冰盒回到原位；2点击计时器，拖动计时器至操作台中央；3再次点击计时器，开始计时（音乐出现倒计时声音，说明框显示“室温静置5分钟”，持续时间3秒钟后隐去），说明框隐去后倒计时声音停止，计时器退回原位置,冰盒移动至操作台中央，EP管自动至冰盒内。

        实验提示: 点击微量吸液器，加入枪头，吸取0.2ml氯仿。

 

 7、加入氯仿----点击微量吸液器（说明框显示“吸取0.2ml液体”，3秒钟后隐去）；2 点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“0.2ml枪头”，3秒钟后隐去），加入到微量吸液器上；3点击微量吸液器，拖动至氯仿处，点击氯仿（枪头内显示吸取0.2ml液体；实验注意：必需按总体积的1/5加入）；4拖动微量吸液器至EP管处，EP管盖子打开，点击微量吸液器（出现枪头内液体注入EP管内的画面），液体注入后，EP管盖子盖上，微量吸液器枪头自动至垃圾桶，微量吸液器回到吸液架上。

         实验注意：氯仿的作用：1、促进有机相和水相的分离；2、去除上清中痕量的酚。

实验提示：剧烈振荡

 

8、振荡---- 1点击EP管（说明框内显示：剧烈震荡15s。EP管上下颠倒混匀振荡，3秒钟后停止，重新位于冰盒内）

     实验提示：静置10分钟

 

      9、静置---- 1点击计时器，拖动计时器至操作台中央；3再次点击计时器，开始计时（音乐出现倒计时声音，说明框显示“静置10分钟”，持续时间5秒钟后隐去），说明框隐去后倒计时声音停止，计时器退回原位置。

      实验提示：点击离心机，配平，开始离心

 

 10、离心---- 1点击离心机，拖动离心机至操作台中央，离心机盖子自动打开，其内可见已放置一配平管（说明框显示“配平管”，持续3秒钟后隐去）；2拖动EP管至配平管对面（其余孔不能放进，放置正确后，离心机盖子自动关闭）；3提示框出现：“选择温度______℃”，“选择转速­­______g”，“选择时间______min”，实验提示分别显示“4℃、12000g、15min”，若提示框内填写正确，提示框自动消失；若任何一项填写错误，提示框持续存在；4点击离心机，开始离心，画面停顿5秒钟后，离心机盖子自动打开（说明框显示“离心结束”），EP管自动出现在操作台中央（EP管内液体分为3层：上层无色透明液体，约0.5ml，鼠标置于该液体层，说明框内显示：“水相”，约3秒钟后说明框隐去；中间白色不透明液体，约0.1ml，鼠标置于该液体层，说明框内显示：“蛋白变性层”，约3秒钟后说明框隐去；下层为红色不透明液体，约0.6ml，鼠标置于该液体层，说明框内显示：“有机相”，约3秒钟后说明框隐去；），离心机盖子盖上，回到原位。

    实验提示：选择新的EP管，点击微量吸液器，装好枪头，转移水相液体至新的EP管内。

 

11、转移---- 1点击操作台左侧另外一只新EP管，并拖动至操作台中央，EP管盖子自动打开；2点击微量吸液器（说明框显示“吸取水相液体”，3秒钟后隐去）；3点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“0.5ml枪头”，3秒钟后隐去），加入到微量吸液器上；拖动微量吸液器至原EP管旁，原EP管盖子自动打开；4微量吸液器伸入原EP管水相液体底层（实验注意提示：“不要碰到蛋白变性层”，），点击微量吸液器吸取0.5ml液体，拖动微量吸液器至新EP管内，再次点击微量吸液器，枪头内液体注入新EP管内；5重复步骤4。6原EP管盖子自动盖上，自动转移至垃圾桶内；微量吸液器枪头自动至垃圾桶，微量吸液器回到原位置；新EP管位于操作台中央。

     实验提示：用微量吸液器加入等体积异丙醇。

 

12、加入异丙醇-----1点击微量吸液器（说明框显示“吸取0.5ml液体”，3秒钟后隐去）；2 点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“0.5ml枪头”，3秒钟后隐去），加入到微量吸液器上；3点击微量吸液器，拖动至异丙醇处，点击异丙醇（枪头内显示吸取0.5ml无色透明液体；实验注意：加入等体积异丙醇）；4拖动微量吸液器至EP管处，EP管盖子打开，点击微量吸液器（出现枪头内液体注入EP管内的画面），液体注入后，EP管盖子盖上，微量吸液器枪头自动至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。

        实验注意：异丙醇的作用：沉淀RNA

实验提示：温和颠倒混匀

 

13、混匀---- 1点击EP管（说明框内显示：温和颠倒混匀。3秒钟后停止）

     实验提示：室温静置10分钟

 

14、静置---- 1点击计时器，拖动计时器至操作台中央；3再次点击计时器，开始计时（音乐出现倒计时声音，说明框显示“室温静置10分钟”，持续时间5秒钟后隐去），说明框隐去后倒计时声音停止，计时器退回原位置, EP管位于操作台中央。

    实验提示：离心10分钟

 

15、离心---- 1点击离心机，拖动离心机至操作台中央，离心机盖子自动打开，其内可见已放置一配平管（说明框显示“配平管”，持续3秒钟后隐去）；2拖动EP管至配平管对面（其余孔不能放进，放置正确后，离心机盖子自动关闭）；3提示框出现：“选择温度______℃”，“选择转速­­______g”，“选择时间______min”，实验提示分别显示“4℃、12000g、10min”，若提示框内填写正确，提示框自动消失；若任何一项填写错误，提示框持续存在；4点击离心机，开始离心，画面停顿3秒钟后，离心机盖子自动打开（说明框显示“离心结束”），EP管自动出现在操作台中央（EP管内液体为无色透明液体，EP管底部可见一小块白色固体物质），离心机盖子盖上，回到原位。

     实验提示：弃去上清

 

16、弃上清----- 1 点击EP管，EP管盖子打开，同时鼠标变为戴一次性手套的手的形状；2手抓住EP管，EP管自动缓慢倾斜，将其内液体倒入垃圾桶内（音乐出现倒水的声音，过程持续3秒钟）；3EP管复位，内无液体，底部仍可见白色固体物质，EP管盖子保持打开。

     实验提示：加入1ml冰乙醇

 

17、加入冰乙醇 ---- 1点击微量吸液器（说明框显示“吸取1ml液体”，3秒钟后隐去）；2 点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“1ml枪头”，3秒钟后隐去），加入到微量吸液器上；3点击微量吸液器，拖动至冰乙醇处，点击异丙醇（枪头内显示吸取1ml无色透明液体；说明框显示：乙醇已预冷）；4拖动微量吸液器至EP管处，EP管盖子打开，点击微量吸液器（出现枪头内液体注入EP管内的画面），液体注入后，EP管盖子盖上，微量吸液器枪头自动至垃圾桶，微量吸液器回到吸液器架上。

       实验注意：冰乙醇的作用：脱水、除盐。

       实验提示：离心

 

18、离心---- 1点击离心机，拖动离心机至操作台中央，离心机盖子自动打开，其内可见已放置一配平管（说明框显示“配平管”，持续3秒钟后隐去）；2拖动EP管至配平管对面（其余孔不能放进，放置正确后，离心机盖子自动关闭）；3提示框出现：“选择温度______℃”，“选择转速­­______g”，“选择时间______min”，实验提示分别显示“4℃、7500g、5min”，若提示框内填写正确，提示框自动消失；若任何一项填写错误，提示框持续存在；4点击离心机，开始离心，画面停顿3秒钟后，离心机盖子自动打开（说明框显示“离心结束”），EP管自动出现在操作台中央（EP管内液体为无色透明液体，EP管底部可见一小块白色固体物质），离心机盖子盖上，回到原位。

        实验提示：弃上清

 

19、弃上清--- 同步骤16

        实验提示：空气干燥5-10分钟

 

20、空气干燥---- 1 画面停顿5s钟，说明框显示“空气干燥10min”。

       实验注意：空气干燥的作用，使乙醇挥发。

       实验提示：加入DEPC水，溶解。

 

21、加入DEPC水---- 1点击微量吸液器（说明框显示“吸取50ul液体”，3秒钟后隐去）；2 点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“0.1ml枪头”，3秒钟后隐去），加入到微量吸液器上；3点击微量吸液器，拖动至DEPC水处，点击（枪头内显示吸取无色透明液体；说明框显示：1%DEPC水）；4拖动微量吸液器至EP管处，EP管盖子打开，点击微量吸液器（出现枪头内液体注入EP管内的画面），液体注入后，EP管盖子盖上，EP管底部白色物质逐渐消失，变为无色透明液体；微量吸液器枪头自动至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。

       实验注意：怎么还不溶？55-60℃水浴可助溶，但时间需控制在10分钟以内。

            实验注意：提取的总RNA置于4℃或冰浴中，立即用于下游实验，或立即置于-80℃冰箱保存。但无论采用何种方法提取和保存的RNA，都往往会被很快降解，因而建议避免提取RNA后保存。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

【左侧】：电泳槽、电泳仪、紫外灯、电子天平（内有称量纸一张）、微波炉、小药勺、微量取液器、盛有消毒枪头的塑料盒、置冰盒中EP管（2只，其中一只内含有少量无色透明液体，鼠标箭头放上，说明框显示：“已提取的总RNA”）、塑料薄膜、三角烧瓶、50ml量筒

   【右侧】：琼脂糖（白色粉末）、加样缓冲液（蓝色）、溴乙锭*（桔红色）

            实验注意：溴乙锭【Ethidium Bromide，EB】：是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。EB是强的变性剂，具有致癌性，操作时必须戴手套！！！ 由于EP具有毒性，实验结束后，应对含有EB的溶液进行净化处理！！！！！你知道什么叫净化处理吗

   【画面中央】：工作台：一块象征性的平台，有“工作台”字样

   【画面右下角】：垃圾桶（有骷髅头图形标记）

   【界面按钮设计】：实验注意：有内容时自动显示

                    实验提示：步箭头放上自动显示，以后每一步均自动显示

                    重新操作：返回到上一步结束

退出实验：回到本步骤界面

退出运行：回到首页

关闭音乐：实验开始，背景音乐自动响起。按此键，即关闭音乐

      实验提示：点击电子天平，点击药勺，称取琼脂糖0.25g。

1、   称取琼脂糖 ----- 1点击电子天平，拖动至操作台中央，电子天平拉门自动打开，可见托盘上已有滤纸一张；2点击药勺，并拖动至琼脂糖处；3点击药勺（动画演示药勺挖取琼脂糖若干），并拖动至电子天平内（动画演示药勺倾斜，琼脂糖落入天平内称量纸上），药勺回原位，电子天平门关上，说明框显示：“0.3g琼脂糖”，3秒钟后滤纸连同琼脂糖自动位于操作台桌面上，电子天平回到原位。

           实验提示：点击量筒，量取1×TAE电泳缓冲液25ml。

 

2、   量取电泳缓冲液----- 1点击量筒，拖动至操作台中央；2点击装有电泳缓冲液的试剂瓶，试剂瓶盖子自动打开，鼠标变为手的形状，移动“手”，抓住试剂瓶，将其内的液体倾倒入量筒内（音乐出现倒水的声音，说明框显示“量取25ml液体”，3秒钟后试剂瓶回到原位，盖子盖上，量筒内显示25ml液体，鼠标变为正常形状）。

           实验提示：点击三角烧瓶，将琼脂糖及量好的电泳缓冲液倒入烧瓶内，并使用微量吸液器，加入1.25ulEB（溴乙锭），于微波炉内加热，溶解琼脂糖。

 

3、   溶解琼脂糖----- 1点击三角烧瓶，并拖动至操作台中央；2点击放有琼脂糖的滤纸，鼠标变为手的形状，抓住琼脂糖滤纸，将琼脂糖倒入三角烧瓶内；3“手”抓住量筒，将量筒内液体倒入三角烧瓶（音乐出现倒水的声音），3秒钟后液体倒完，鼠标变回原来的形状，量筒回到原位置，滤纸回到垃圾桶内；4点击微波炉，并拖动至桌面中央，微波炉盖子打开； 5点击三角烧瓶，鼠标变为手的模样，抓住三角烧瓶，移动至微波炉内，三角烧瓶口自动出现一盖子，微波炉盖子关闭； 6点击微波炉，说明框显示“溶解琼脂糖”，琼脂糖颗粒逐渐溶解，变为无色透明液体，持续约30秒钟，微波炉盖子打开。实验注意：小心！不要使琼脂糖满溢至烧瓶外！ 7点击微波炉内的三角烧瓶，鼠标变为一只白色工作手套状，自动拿起三角烧瓶，放置于操作台桌面上，画面停顿3秒钟（说明框显示：冷却至大约60℃，不要冷却时间过长，避免琼脂糖凝固）；8点击微量吸液器，并拖动至操作台中央，点击微量吸液器枪头，枪头装至微量吸液器上；拖动微量吸液器至溴已锭处，说明框显示“有毒，小心操作，并出现一骷髅头画面”，3秒钟后消失；9点击微量吸液器，动画显示淡红色液体吸入枪头的画面，说明框显示“吸取1.25ul溴已锭”，3秒钟后消失；10拖动微量移液器至三角烧瓶内，烧瓶盖子自动至垃圾桶，画面显示液体注入到瓶内的画面，枪头自动到垃圾桶，微量吸液器回到移液架。

        实验提示：将加样梳放置于胶板上，将溶解后的琼脂糖倒入胶板内，待琼脂糖凝胶凝固后拔出点样梳。

        实验注意：凝胶颗粒必须完全溶解【图示琼脂糖完全溶解和部分溶解对实验结果影响的图】

 

4、   浇板----- 1点击胶板，并拖动至操作台中央；2点击点样梳，点样梳自动架至胶板一端，说明框显示“齿梳的底部离胶板平面的距离为0.5-1mm”；3点击三角烧瓶，鼠标变为戴手套手的形状，抓住三角瓶，三角烧瓶缓慢倾倒，液体注入胶板内，胶板内液体逐渐增加（画面要有液体为稍粘稠的感觉），说明框内显示“注意避免气泡”，3秒钟后说明框隐去，液体倒完，鼠标变为原形状，三角烧瓶回到原位置；4胶板内的琼脂糖胶在室温逐渐凝固成半透明的乳白色的固体（约3秒钟），点击点样梳，点样梳回到原位，画面显示胶板内的琼脂糖为乳白色半透明的固体，一端可见点样孔。

            实验提示：点击并拖动电泳槽至操作台中央，将胶板小心放入电泳槽内。

 

5、   准备电泳槽 ----- 1点击电泳槽，并拖动电泳槽至操作台中央，其内可见无色透明液体（说明框显示：1*TAE电泳缓冲液）；2 点击胶板，鼠标变为手的形状，把胶板将其放入电泳槽内（实验注意显示：点样孔一端置电泳槽的阴极）。   

实验提示：使用微量吸液器，吸取5ul总RNA，点于塑料薄膜上.

 

6、吸取样品 ---- 1点击含有RNA的EP管，并拖动至操作台中央，EP管盖子打开；2点击塑料薄膜，拖动至操作台中央；3点击微量吸液器（说明框显示“吸取5ul总RNA液体”，3秒钟后隐去）；4点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“10ul枪头”，3秒钟后隐去），加入到微量吸液器上；5拖动微量吸液器至EP管处，点击微量吸液器（出现EP管内含有总RNA的液体吸入枪头内的画面）；6拖动微量吸液器至塑料薄膜处，点击微量吸液器，吸液器内液体滴入到塑料薄膜上（液体为一个小水滴状）；7EP管盖子自动盖上，微量吸液器枪头自动至垃圾桶，微量吸液器回到移液架上。

实验提示：使用微量吸液器吸取6×上样缓冲液（Loading buffer）1ul，滴入塑料薄膜上的总RNA液滴中，反复吸取几次，混匀，避免气泡出。

 

7、吸取上样缓冲液---- 1点击微量吸液器（说明框显示“吸取1ul液体”，3秒钟后隐去）；2点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“10ul枪头”，3秒钟后隐去），加入到微量吸液器上；3拖动微量吸液器至上样缓冲液处（蓝色），点击微量吸液器（出现EP管内液体吸入枪头内的画面）；4拖动微量吸液器至塑料薄膜处，点击微量吸液器，吸液器内液体被打到塑料薄膜上的总RNA的液滴内（液体为一个小水滴状），反复吸取液体几次，混匀，液体变为均匀淡蓝色；5微量吸液器枪头自动至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。

      实验提示：点击电泳槽，将塑料薄膜上的液体加入到电泳槽上的凹槽内。

 

8、上样 ---- 1点击电泳槽，并拖动至操作台中央（电泳槽内靠近阴极侧可见一排点样孔）；2点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“10ul枪头”，3秒钟后隐去），枪头加入到微量吸液器上；3拖动微量吸液器至塑料薄膜处，点击塑料薄膜上的液体（出现塑料薄膜上液体吸入枪头的画面）；4拖动微量吸液器至凝胶板上的点样孔处，点击微量吸液器（出现液体注入凝胶孔内的画面，液体为淡蓝色的液体）。

        实验提示：点击电泳仪，连接正负极，开始电泳。

 

9、电泳 ----- 1点击电泳仪，电泳仪移动至操作台中央；2点击电泳槽上的“阴极”显示扭，链接到电泳仪的“阴极”（出现黑色导线链接两端的画面），点击电泳槽“阳极”显示扭，链接到电泳仪的“阳极”（出现红色导线链接两端的画面）；2持续点击电泳仪上“电压选择”按钮，电泳仪显示屏上电压从“50V”快速升高到“100v”；持续点击电泳仪上“时间选择”按钮，电泳仪显示屏上时间从“10min”快速升高到“30min”；点击电泳仪上“开始”按钮，说明框显示“开始电泳”，画面显示电泳仪阴极不断出现很多微小气泡，蓝色液体逐渐向阳极移动（画面持续5秒钟）；3说明框显示“30分钟后”，蓝色液体移动至琼脂糖凝胶的中间。

        实验提示：点击紫外分析仪，观察结果。

 

10、观察结果---- 1点击紫外分析仪，紫外分析仪自动移动至操作台中央；2点击电泳槽，拖动琼脂糖凝胶至紫外分析仪中的平板上。电泳仪、电泳槽回到原位；3点击紫外分析仪，观察结果，画面显示“三条带”，说明框显示“28s ，18s，5sRNA”。

实验提示：准备分光光度计分析RNA纯度，点击EP管，稀释RNA。

 

    11、准备EP管----点击新的EP管，并拖动至工作台中央的冰盒内（EP管外显示刻度0.5ml，1.0ml，鼠标置于EP管上，说明框内显示“1.5mlEP管”，3秒钟后隐去）。

实验提示：加入DEPC水98ul

 

12、加入DEPC水98ul---- 1 点击微量吸液器（说明框显示“吸取98ul液体”，3秒钟后隐去）；2 点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“100ul枪头”，3秒钟后隐去），加入到微量吸液器上；3点击微量吸液器，拖动DEPC水处，点击DEPC水（枪头内显示吸取98ul白色液体）；4拖动微量吸液器至EP管处，点击微量吸液器（出现枪头内液体注入EP管内的画面），液体注入后，EP管盖子盖上，微量吸液器回到原位置。

实验提示：加入RNA2ul

 

    13、加入RNA2ul ---- 1 点击微量吸液器（说明框显示“吸取2ul液体”，3秒钟后隐去）；2 点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“10ul枪头”，3秒钟后隐去），加入到微量吸液器上；3点击微量吸液器，拖动RNA处，点击RNA水（枪头内显示吸取2ul白色液体）；4拖动微量吸液器至EP管处，点击微量吸液器（出现枪头内液体注入EP管内的画面），液体注入后，EP管盖子盖上，微量吸液器回到原位置。

 实验提示：将稀释的RNA加入比色皿中

 

     14、将稀释的RNA加入比色皿中----①点击比色皿，并拖动至工作台中央的冰盒内，② 点击微量吸液器（说明框显示“吸取100ul液体”，3秒钟后隐去）；③ 点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“100ul枪头”，3秒钟后隐去），加入到微量吸液器上；④点击微量吸液器，拖动稀释的RNA处，点击稀释的RNA水处（枪头内显示吸取100ul白色液体）；⑤拖动微量吸液器至EP管处，点击微量吸液器（出现枪头内液体注入EP管内的画面），液体注入后，EP管盖子盖上，微量吸液器回到原位置。

实验提示：点击分光光度计，分析RNA纯度

 

15、点击分光光度计，分析RNA纯度----1点击分光光度计，拖动分光光度计自动移动至操作台中央，分光光度计盖子自动打开；2将比色皿加入分光度计内，分光光度计盖子自动合上；3点击“开始分析”，观察结果，画面显示“A260/A280=2.0”。

 

实验注意：通过电泳的结果观察分析提取的总RNA有无降解：完整的RNA的电泳可明显观察到28s和18s两条带，并且28s大约是18s的两倍宽。若两条带不明显，则说明RNA部分降解。

RNA的纯度确定：A260/A280≈2.0，如果A260/A230<2，除盐不充分。

计算RNA的浓度：RNA原液的浓度=（A260-A230）*稀释倍数*40（ng/ul）

 

  【左侧】：PCR仪、盛有冰的容器（不带盖）、微量取液器、盛有消毒枪头的塑料盒、EP管

   【右侧】：总RNA、MgCl₂(25mM)（无色液体，水滴状表示）、Reverse transcription 10*Buffer（白色透明波浪状液体）、dNTP Mixture(10mM)（A、T、G、C）、RNase Inhibitor（白色球状液体）、Random 9 mers（单链RNA状）、Reverse Transcriptase（   状）、DEPC水（水滴状）

   【画面中央】：工作台：一块象征性的平台，有“工作台”字样

   【界面按钮设计】：实验注意：有内容时自动显示

                    实验提示：步箭头放上自动显示，以后每一步均自动显示

                    重新操作：返回到上一步结束

退出实验：回到本步骤界面

退出运行：回到首页

关闭音乐：实验开始，背景音乐自动响起。按此键，即关闭音乐

       实验提示：将2ul总RNA加入EP管，点击PCR仪，70℃孵育10分钟。

1、 孵育 ---- 1点击EP管， EP管盖子自动打开，EP管自动移动至桌面中央；2点击微量吸液器（说明框显示“吸取2ul液体”，3秒钟后隐去）；3点击装有消毒枪头的塑料盒（说明框显示“10ul枪头”，3秒钟后隐去），枪头自动加入到微量吸液器上（枪头为黄色）；4点击微量吸液器，拖动至总RNA处，点击总RNA（枪头内显示吸取2ul无色透明液体）；5拖动微量吸液器至EP管处，点击微量吸液器（出现枪头内液体注入EP管内的画面），液体注入后，EP管盖子盖上，微量吸液器回到移液架上，枪头自动至垃圾桶内;6点击PCR仪，并拖动至操作台中央，PCR仪盖子自动打开;7拖动EP管放入PCR仪内,PCR仪盖子自动盖上（说明框显示：孵育：______℃,时间:­_______分钟;实验提示:孵育70℃,10分钟,若填错,实验不能继续）；8说明框显示:“10分钟后”，3秒钟后隐去,PCR仪盖子自动打开,EP管位于桌面上的冰盒内,PCR仪盖子关上,PCR仪回到原位。

         实验注意：去除RNA二级结构。

      实验提示：将EP管立即拖动至盛有冰的容器内。

 

2、配制反应液----- 1点击MgCl₂(25mM)，说明框显示：加入______ul，实验提示：4ul，若填错,实验不能继续；填写正确后，MgCl₂(25mM)自动加入EP管内，EP管内液面上升；2点击Reverse transcription 10*Buffer，说明框显示：加入______ul，实验提示：2ul，若填错,实验不能继续；填写正确后Reverse transcription 10*Buffer自动加入EP管内，EP管内液面上升；3同上依次加入dNTP Mixture(10mM) 2ul、RNase Inhibitor 0.5ul、Random 9 mers 1ul、Reverse Transcriptase 1ul、DEPC水 7.5ul；4加入完成后，EP管盖子自动盖上，自动混匀。

实验注意：以上液体加入不分先后顺序，均需使用微量吸液器。

       实验提示：点击PCR仪，进行cDNA反应。

 

3、逆转录----- 1点击PCR仪， PCR仪自动移动至操作台中央，盖子自动打开;2拖动EP管放入PCR仪内,PCR仪盖子自动盖上，冰盒回到原位（说明框显示：30℃，_______分钟；42℃，_______分钟；95℃，_______分钟；5℃，_______分钟。实验提示显示：10分钟，15分钟，5分钟，5分钟）。3填写完毕后，说明框提示：开始运行，5秒钟后隐去，PCR仪盖子打开，EP管位于操作台中央，PCR仪回到原位。

         实验提示：cDNA制备完成。

         各种温度设置的作用

 

 

 

 

 

 

 

 

  【左侧】：PCR仪、振荡器、微量取液器、盛有消毒枪头的塑料盒、EP管

   【右侧】：cDNA模板（DNA双链结构样表示）、MgCl₂(25mM) （无色液体，水滴状表示）、10*Buffer（白色透明波浪状液体）、dNTP Mixture(10mM)（AGTC）、Taq酶（   样，鼠标放上实验注意：-20℃保存，切勿反复冻融）、Forward引物（白色透明水滴状液体）、Reverse 引物（白色透明水滴状液体）、DEPC水（无色水滴状液体）

   【画面中央】：工作台：一块象征性的平台，有“工作台”字样

   【画面右下角】：垃圾桶（有骷髅头图形标记）

   【界面按钮设计】：实验注意：有内容时自动显示

                    实验提示：步箭头放上自动显示，以后每一步均自动显示

                    重新操作：返回到上一步结束

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