接触式超声在胞内蛋白及核酸提取过程中的应用

背景

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），又称内毒素，为革兰氏阴性菌细胞壁外壁的组成成分，可作用于膜受体激活多种细胞（巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等）信号转导系统，促进促炎细胞因子和其他炎性介质的合成及释放，引发炎症反应。客户采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症模型，使用超声波细胞粉碎机将蛋白及核酸从炎症细胞中分离出来，从基因、蛋白相对表达水平方面评估羊栖菜多酚（Hizikia fusiformis polyphenols，HFPs）的抗炎活性，为其在新型抑炎制剂的开发利用提供理论依据。

材料与方法

1.1⽺栖菜多酚的制备

取⼲燥⽺栖菜粉末，加⼊体积分数60%⼄醇溶液，使⽤SCIENTZ-IID超声辅助浸提（料液⽐1∶20（m/V）、50 ℃、60 min），抽滤后真空减压蒸馏去除⼄醇，获⽺栖菜粗多酚溶液，依次采⽤等体积⽯油醚、⼄酸⼄酯分级萃取，真空减压蒸馏后冻⼲（使⽤SCIENTZ-12N过夜冻⼲），获得HFPs粉末。测得HFPs粉末总酚含量为23.67±0.24 mg/g。利⽤⽆菌⽔配制成多酚⺟液，再以细胞培养液稀释⾄不同浓度，⽤于后续实验。

1.2 炎症细胞培养

使⽤完全培养基（含10%（体积分数，下同）胎⽜⾎清和1%⻘链霉素双抗DMEM培养基）培养RAW264.7细胞，37 ℃、5% CO2培养，细胞融合度约80%时进⾏传代。然后分成3组进⾏培养：①阴性对照组，仅加⼊含10%胎⽜⾎清的DMEM培养基；②LPS阳性对照组，加⼊含LPS（1μg/mL）和10%胎⽜⾎清的DMEM培养基刺激24 h；③HFPs+LPS组，经含不同质量浓度（10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350 μg/mL）HFPs和10%胎⽜⾎清的DMEM培养基培养24    h后，以含LPS（1 μg/mL）和10%胎⽜⾎清的DMEM培养基刺激24h。

1.3 RAW264.7细胞炎症相关基因相对表达量的测定

1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，⽤0.01 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞2 次，每孔加⼊500 μL TRIzol试剂，使⽤SCIENTZ-IID加速破碎细胞协助提取总RNA，超声参数为：100 W，1 s 开1 s关，共1 min，并将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，采⽤SYBR Green嵌合荧光法与引物进⾏实时荧光定量PCR。测定⽬的基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS）和内参基因次⻩嘌呤磷酸核糖基转移酶1（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt1）Ct值，采⽤2－ΔΔCt法计算⽬的基因的相对表达量。

1.4 MAPKs、NF-κB信号通路关键蛋⽩相对表达量测定

1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，⽤0.01 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞2 次，加⼊200 μL RIPA细胞裂解液，使⽤SCIENTZ-IID加速破碎细胞协助提取蛋⽩质，超声参数为：100 W，1 s 开1 s关，共1 min，离⼼（12000 r/min、4 ℃）10 min取上清液。采⽤BCA蛋⽩质量浓度测定试剂盒测定各组蛋⽩浓度，⽤蛋⽩上样缓冲液调整蛋⽩质量浓度为2 mg/mL，95 ℃加热10 min使蛋⽩变性然后进⾏⼗⼆烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝㬵电泳分离；湿转到聚偏⼆氟⼄烯膜；5%（质量分数）脱脂奶粉（TBST溶液配制）封闭1 h；⼀抗4 ℃孵育12 h；⼆抗室温孵育2 h；加⼊ECL试剂进⾏显⾊反应，测定蛋⽩条带灰度值。以β-actin为内参，⽬的蛋⽩包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和pJNK，分别以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表⽰相应蛋⽩磷酸化⽔平。

结果与分析

01.RAW264.7细胞炎症相关基因相对表达量的测定结果

采⽤实时荧光定量PCR测定HFPs对LPS诱导的巨噬细胞中重要促炎细胞因⼦IL-1β、IL-6和接触式超声在胞内蛋⽩及核酸提取过程中的应⽤TNF-α基因相对表达量，以及炎症相关酶COX-2基因相对表达量的影响。如图1所⽰，LPS刺激不同时间后，所有炎症介质的mRNA表达⽔平均显著提⾼（P＜0.05）。HFPs对促炎细胞因⼦的抑制作⽤与其剂量、LPS诱导时间及细胞因⼦种类相关。与LPS组相⽐，静息状态细胞经HFPs处理再经LPS诱导12、24 h后，IL-1β和IL-6的基因相对表达量显著下降；HFPs显著抑制LPS诱导3 h后TNF-α基因的相对表达，⽽在LPS诱导6〜24 h的抑制作⽤总体不明显。在LPS诱导24 h，较低剂量HFPs（30、60 μg/mL）预处理对COX-2基因表达具有显著抑制作⽤，但提⾼剂量后该抑制效果消失，甚⾄出现反向促进作⽤，120 μg/mL HFPs预处理促使COX-2相对表达量较LPS组显著上升（P＜0.05）。

02.MAPKs、NF-κB信号通路关键蛋⽩相对表达量测定结果

采⽤蛋⽩免疫印迹法测定巨噬细胞中MAPKs和NF-κB信号通路关键蛋⽩的磷酸化⽔平。如图2所⽰，与阴性对照组相⽐，LPS刺激3 h后细胞中p38、JNK和p65蛋⽩的磷酸化⽔平显著升⾼（P＜0.05）。90、120 μg/mL HFPs预处理对LPS诱导的巨噬细胞中p38和p65的磷酸化产⽣显著抑制作⽤（P＜0.05），且呈⼀定的剂量依赖性，但对JNK的磷酸化没有显著影响，表明HFPs的抗炎作⽤可能与其靶向作⽤于p38 MAPK和NF-κB p65有关。

总结

客户采⽤LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建⽴体外炎症模型，使⽤超声波细胞粉碎机将蛋⽩及核酸从炎症细胞中分离出来，从基因、蛋⽩相对表达⽔平⽅⾯评估⽺栖菜多酚（Hizikia fusiformispolyphenols，HFPs）的抗炎活性，为其在新型抑炎制剂的开发利⽤提供理论依据。超声波细胞粉碎机在整个实验中起到作⽤如下：

1. 辅助提取⽺栖菜中多酚组分，加速多酚组分释放，缩短了提取进程，后续通过冻⼲步骤即可获得⽺栖菜多酚粉末，溶解后备⽤；

2. 搭配TRIzol试剂对细胞中总RNA进⾏提取，试剂中含有苯酚，可加速细胞破碎和核酸释放，还加⼊核酸酶抑制物质防⽌RNA降解，PCR结果表明提取的RNA浓度与纯度较好，可⽤于相关基因表达情况的分析；

3. 搭配RIPA裂解液对细胞中的蛋⽩质进⾏提取，⼤幅减少原本冰上裂解所需时间（30 min），试剂中含有的蛋⽩酶抑制剂可防⽌蛋⽩降解，还含有磷酸酶抑制剂，防⽌蛋⽩提取后的再修饰，更好测定蛋⽩磷酸化状态。