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▲NGS高通量测序基本流程
Basicprocess for high-throughput sequencing NGS
对长链DNA(通常指生物染色体DNA)片段化的主要原因是短链DNA片段有利于进行DNA分子快速杂交和高灵敏目标检测,可显著提升测序效率。目前,常用的染色体脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)分子片段化方法主要有四种,分别为:DNA限制性酶切法、水动力剪切法、超声波断裂法、喷射雾化法,四种方法各有利弊。
▲DNA分子结构形态
Molecularstructure and morphology of DNA
超声打断基于水动力剪切法和超声波断裂法,是最常见的DNA片段化方式。其原理为:液体在高频率的脉冲作用下,产生无数的高压点和低压点,伴随产生的空化泡存在几毫秒又因压力变化而爆破,在这个过程中液体内形成瞬时高强度剪切力,这种作用力可以破碎细胞、影响蛋白质和剪切DNA。在此特别推荐新芝生物的一款特色产品:SCIENTZ18-A超声波DNA打断仪,采用非接触式的工作方式,单次最高处理量可达12个样品,是染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)和DNA剪切研究平台的标准化工具。
超声波DNA打断仪是将DNA暴露于均匀的超声体系中进行无偏剪切,从而产生的大量均匀大小的双链DNA,具有以下优势:
样品零污染:非接触式封闭破碎,降低污染风险
处理效率高:单次可处理12个样品,处理速度快
无差别打断:DNA片段集中无偏好
等温处理:配备冷水机,恒温打断防止ChIP实验中蛋白质变性
使用高速分散器(例如XHF-DY)或研磨器(例如SCIENTZ-12或DY89-II)将生物样品于冰浴条件(例如XB-70)下进行处理以获得均质溶液;
对获得的均质溶液,一般使用超声细胞破碎机(例如为SCIENTZ-IID)或高压细胞破碎机(例如JG-IA)进行处理,特殊样品可配置冰浴环境,以获得含有细胞内容物的溶液;
对细胞破碎后的溶液进行冷冻离心(例如HSC-2015L),取上清液备用;
4.1将破碎后溶液放置于0.2 mL或0.5 mL EP管,于适配器中旋紧螺母进行固定;
4.2将适配器置于水浴环境中,开启配套冷水机,设置温度为6℃;
4.3待温度降至设定温度时,设定DNA打断参数(如超声开20 s,超声关25 s,功率300 W,超声总时间30 min),启动打断程序;
4.4完成打断后,取下DNA样品低温保存防止降解,用于进一步研究。
▲大肠杆菌DNA打断效果
▲DNA浓度为50ng/uL的打断效果
SCIENTZ18-A超声波DNA打断仪采用恒温、非接触的方式对样品进行打断、匀浆和混合,具有无菌操作、无损作业、微量打断的特点,同时处理多个样品可完美适配二代测序,适用于多类生物样品,是ChIP和DNA剪切研究平台的重要工具。