生物化学与分子生物学虚拟实验室

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虚拟实验（以下为一组）：

 

 实验目的：熟悉RT-PCR的反应原理、掌握RT-PCR反应的操作步骤及RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法。

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聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction PCR）或称体外基因倍增，是一种体外扩增DNA片段的技术。PCR技术即在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合的酶促反应。其特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性。

PCR技术一般需进行以下三个过程：

变性：加热模板DNA，使双链DNA分子解离成单链DNA。

退火：当温度下降时，引物DNA与所要扩增基因两侧的DNA配对形成局部杂交链。

延伸：在合适的温度，合适的缓冲液，Mg²⁺及4种dNTP存在条件下，DNA聚合酶引物3’-OH游离端，根据模板的碱基顺序合成新的互补链。

      上述三个过程即变性-退火-延伸为一个循环，如此重复进行，经30次左右的循环，模板DNA在数小时扩增倍数为（1+X）ⁿ。X为扩增效率，n为循环次数。

      逆转录PCR（RT-PCR）又称RNA-PCR，首先提取组织细胞总RNA，加入与mRNA3’端互补引物，在逆转录酶作用下合成cDNA，然后以cDNA为PCR模板，加入与cDNA互补的另一引物进行PCR扩增。RT-PCR可用于cDNA克隆，cDNA文库构建，基因表达研究等。

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在所有的RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败 的主要原因是RNA酶的污染。

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关键试剂：Trizol、氯仿、异丙醇、1%的DEPC水、逆转录试剂盒、PCR试剂盒

实验器材：电动匀浆器、振荡器、冷冻离心机、小型台式高速离心机、常规PCR仪、电泳仪、紫外分光光度计等。                                   

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