实验目的

　　麦角甾醇化学名为24β-甲基胆固醇-5，7烯-3β-羟基，分子式为C28H44O。麦角甾醇是微生物细胞膜的重要组成成分。抑制麦角甾醇的生物合成是目前杀菌剂的重要作用机制之一。真菌干菌丝中麦角甾醇含量一般维持在2～24mg/g之间，大部分在5mg/g左右。真菌细胞膜被一层厚实、坚韧并具有弹性的细胞壁包裹，对细胞起保护作用，必须将细胞壁破碎使胞内物质释放才能进一步提取。因此，禾谷镰孢菌细胞破碎是检测麦角甾醇含量的关键步骤。目前，真菌中主要采用的是皂化法、超声波和微波3种方法进行细胞破碎，其中，皂化法存在提取时间较长，温度高，有机溶剂使用量大，安全系数小等缺陷;超声波和微波提取尽管省时、节能、高效，但对于细胞壁较为坚硬的真菌细胞，破壁效率低，单独使用难以达到理想的破壁效果。因此，本研究拟建立超声辅助皂化法提取禾谷镰孢菌麦角甾醇的方法，并利用HPLC进行定量分析，为进一步研究禾谷镰孢菌的麦角甾醇奠定基础。

实验步骤

　　单因素试验及响应⾯优化试验 :单因素试验:称取禾谷镰孢菌粉末，考察KOH含量(0.01，0.015，0.02，0.025，0.03和0.04g/mL)、超声提取温度(20℃，30℃，40℃，50℃和60℃)、液固比(20，40，100，200和400mL/g)及超声提取时间(5，10，15，20和30min)对禾谷镰孢菌麦角甾醇提取量的影响。响应面优化试验设计，在单因素试验基础上，以麦角甾醇提取量为响应值，乙醇中碱含量、提取温度、液固比和超声提取时间为自变量进行提取条件优化。

实验结果

　　皂化过程中可通过碱来解离结合的麦角甾醇，试验采用乙醇提取麦角甾醇，因此乙醇中碱含量对于麦角甾醇的提取十分重要。通过单因素试验提取麦角甾醇结果见图1。如图1(A)所示，当碱含量约为0.03g/mL，皂化效果较好。植物原料中皂化温度越高，麦角甾醇的皂化效率越高，一般情况下，皂化温度越高，皂化程度越剧烈，超声加速细胞壁破壁，溶解，更有利于皂化反应的进行，通常在70℃可完全皂化。图1(B)所示超声辅助后，在40℃麦角甾醇提取量即可达到平衡，说明超声辅助皂化可以显著降低皂化温度，降低皂化能耗。图1(C-D)所示，当液固比和超声提取时间增加时，禾谷镰刀菌中麦角甾醇的提取量呈现先增大后减小的趋势;在液固萃取时，液固比不同，液相、固相之间的浓度差就不同，传质推动力就会出现快慢，影响提取效果。超声提取时间的增加会增加细胞破碎程度，使得麦角甾醇更易于发生皂化反应，皂化反应完成后，超声可能会破坏麦角甾醇结构，致使其含量下降。因此综合考虑提取量、效率、成本等各项因素，选择KOH含量0.03g/mL、温度40℃、液固比200mL/g、超声时间15min为中心点进行响应面分析试验。

图1各因素对⻨⾓甾醇提取量的影响

实验讨论

　　采用超声辅助皂化法提取麦角甾醇，通过单因素和响应面优化，对影响麦角甾醇提取效果的主要因素进行研究，并建立禾谷镰孢菌菌丝中麦角甾醇的提取方法。结果表明，各因素对麦角甾醇提取量的影响程度依次为:碱含量>液固比>时间>温度。最佳提取条件为碱含量为0.034g/mL、温度为36℃、液固比为200mL/g、超声提取时间8min，在该提取条件下，麦角甾醇提取量高达0.88mg/g。该方法线性范围为3.125～200μg/mL，回收率达到82%以上，以其作为小麦禾谷镰孢菌固态发酵生物量的指标，可信度高，也可被借鉴于其他真菌的相关研究和应用中。

[1]郭瑞,饶斌,吴琴燕,等.超声辅助皂化提取禾谷镰孢菌中麦角甾醇及其HPLC分析[J].分析试验室,2019,38(11):1353-1358.DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2019.022006.